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Chromatine et réplication de l’ADN

Marta Radman-Livaja

Projets de recherche

Nous sommes intéressés par le rôle de la chromatine dans la transmission épigénétique des phénotypes cellulaires. Nous avons deux principaux projets pour étudier les mécanismes de maintenance de la structure chromatinienne après la réplication du génome et la division cellulaire :

1.Dynamique de l’assemblage de la chromatine au cours de la réplication de l’ADN

(subvention ERC-consolidateur NChIP 647618 ; 2015-2020)

L’assemblage de la chromatine est un processus cellulaire fondamental qui est nécessaire au maintien de l’intégrité du génome et des programmes transcriptionnels. Nous avons pour but de comprendre l’effet de la réplication de l’ADN sur les histones, afin de mieux comprendre le rôle de la chromatine dans hérédité épigénétique. Les phénomènes épigénétiques influencent la différenciation cellulaire et la formation du cancer, ainsi que l’impact des facteurs environnementaux sur le développement précoce et plus tard sur les prédispositions aux maladies. Bien que l’hérédité épigénétique des composants de la chromatine soit, en principe, accepté comme le pilote de ces phénomènes, l’héritage des états chromatiniens en soi a seulement été démontré pour quelques cas particuliers. Très peu est connu sur l’héritage des histones maternelles au-delà des faits que les histones maternelles sont reparties aléatoirement entre les deux brins d’ADN répliqués, qu’elles sont diluées deux fois par le lien des histones nouvellement synthétisées et que la majorité des tétramères H3/H4 restent intacts lors du réassemblage sur les chromatides filles. Nous avons déjà montré que les nucléosomes maternelles restent en moyenne 400bp en amont ou en aval de leur site de fixation original, ce qui implique que toute information potentiellement héréditaire codée dans la chromatine doit être héritée en blocs de ~ 1 Kb, car des régions plus petites seraient rapidement être diluées par les nouveux nucléosomes. Nous développons des techniques à haut débit (par exemple NChAP-Nascent Chromatin Avidin Pulldown ; figure 1) pour mesurer directement les mouvements des histones et des régulateurs de la chromatine pendant la réplication génomique dans S.cerevisiae afin de déterminer comment les états de la chromatine survivent les perturbations associées à la réplication. Cela nous permettra d’évaluer la propagation des nucléosomes maternelles et de leurs modifications post-traductionnelles après la réplication dans le génome entier.

Figure 1: Nascent Chromatin Avidin Pull-Down

(A) Diagram of nascent chromatin avidin pull-down (NChAP). For synchronized cells, after arrest in G1, cells are released into fresh media in the presence of EdU and aliquots are fixed at regular time intervals. In asynchronous populations, cells are pulsed with EdU, followed by a thymidine (T) chase. Chromatin is digested with MNase, and the isolated DNA fragments are subject to a click reaction that adds biotin to the incorporated EdU. Biotinylated DNA is purified with streptavidin-conjugated magnetic beads, and NGS libraries are constructed on DNA fragments attached to the beads. cDNA strands are separated with primer extension in the presence of dUTP. The dUTP-containing strand is then digested with USER enzymes prior to PCR. This ensures that only nascent strands are sequenced.

(B) Density distribution of DNA content measured by flow cytometry before arrest (mid-log) in G1 and at indicated times after release from G1 arrest (left panel). Nascent chromatin Watson (W) strand read distribution on chromosome 2 at indicated times after release (blue bars) and total chromatin input are shown (total MNase-digested chromatin isolated prior to the click reaction; 32.5-, 40-, and 55-min time points, pink bars). Replication origins (ARS) are shown in the two bottom rows: ARS from this study (first) and previously documented ARS (second) are shown. Read counts were grouped in 400-bp bins and first normalized to the genome average read count and then to the highest peak value in each chromosome.

2.Ségrégation asymétrique des composants de la chromatine

(ANR GENCHROSEG; 2014-2018)

La division cellulaire asymétrique est indispensable à la différenciation des cellules souches. La transformation phénotypique au cours de la différenciation est un phénomène épigénétique mal compris, dans lequel la chromatine, comme un régulateur transcriptionnel, théoriquement jouerait un rôle. L’hypothèse de la répartition asymétrique des composants de la chromatine lors des divisions asymétriques n’a toutefois pas été systématiquement testée. La levure bourgeonnante se divise asymétriquement produisant des cellules filles et cellules mères. Une mère peut générer 20-30 filles durant sa vie réplicative, et la plupart des facteurs épigénétique qui déterminent l’identité phénotypique de la cellule mère sont inconnus. Nous utilisons la microscopie à fluorescence pour élucider comment les protéines liées à la chromatine sont ségrégées lors de la division cellulaire (Figure 2).

Figure 2

HHF2dendra2 lineage in a microfluidic chamber. Dendra2 is a photoconvertible fluorescent protein that we fused to histone H4 (HHF2). The photo conversion feature allow us to differentiate between already synthesized maternal proteins, which will fluoresce in the red spectrum after a blue laser light pulse, and the green fluorescent proteins synthesized after the blue light pulse. Microfluidic chambers make it easier to automatically identify mother and daughter pairs. Top: frame from a film of dividing cells (photos taken every 3 min). Time 0 is right after the photo-conversion. Bottom: The red signal is divided equally between the mother and the daughter cells until it is reduced to background levels in 2 to 3 generations, as shown in the mother daughter red fluorescence scatter plot on the left and the pedigree heat map on the right.

Membres

Team leader

Marta RADMAN-LIVAJA

Chercheur

(+33) 04 34 35 96 67

212

Pritha BHATTACHARJEE

Post-Doc

+33 (0)4 34 35 9665

Alain CAMASSES

IR-Recherche

(+33) 04 34 35 96 67

Arame FALL

AI-Recherche

+33 (0)4 34 35 96 67

Ana HRGOVCIC

Doctorant

+33 (0)4 34 35 96 67

212

Saphia TONAZZINI

IE-Recherche

+33 (0)4 34 35 96 67

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Financement

ERC

ANR

Interactions
At IGMM

Etienne Schwob

At Illkirch

Gilles Charvin (IGBMC, Illkirch)

 

Toutes les équipe de recherche

Mots-clés
Model organism studied
Saccharomyces Cerevisiae
Biological process
Le maintien de la structure chromatinienne pendant la réplication génomique
Biological techniques
Biologie Moléculaire, Génétique, Séquençage à haut débit, Microscopie du vivant, Bio-informatique