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Protéines disponibles *

Protéine Tag Poids moléculaire Concentration Tampon de stockage
TEV protease 6His 27 kDa 0,8 mg/mL 50 mM HEPES pH 7,5 – 1 mM DTT – 45% glycerol
Cas9-GFP 6His, MBP 236 kDa 3,7 mg/mL 20 mM HEPES pH 7,5 – 150 mM KCl – 1 mM DTT – 50% glycerol

(*): ces protéines seront à terme distribuées via le magasin. Dans l’immédiat, vous pouvez vous les procurer en les demandant directement à Sarah Benlamara ou Olivier Coux.

Procédures et contrôles de qualité :

TEV protease :

La protéase a été exprimée en utilisant le plasmide 6His-pTEV (backbone pET28  - carte disponible sur demande), dans la souche E.coli Rosetta pLysS. Elle a ensuite été purifiée par affinité sur une colonne Ni-NTA, puis par échange d’anions après dessalage. La fraction pure a été centrifugée pour enlever les agrégats et stockée dans 50% glycérol.

Son activité a ensuite été testée en utilisant la Cas9-GFP, qui présente un site TEV entre le tag 6H-MBP et la Cas9-GFP.

L’efficacité de coupure dépend de l’accessibilité du site de fixation de l’enzyme et peut donc varier énormément d’un susbtrat à l’autre. Nous recommandons d’adapter la quantité de TEV au substrat, en réalisant une gamme en quantité décroissante de TEV à partir de 1 µg de TEV pour 1 µg de substrat.

Analyse de la pureté (Coomassie – 10% acrylamide) :

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Cas9-GFP

La protéine a été exprimée à partir de la construction 6His-MBP-Cas9-GFP (addgene pMJ922) dans la souche E.coli Rosetta pLysS. Elle a été purifiée selon les étapes suivantes :

  • Affinité sur colonne Ni-NTA
  • Echange de cations sur colonne MonoS
  • Gel filtration sur colonne Superdex 200.

Elle a été ensuite concentrée (Vivaspin) à 3,7 mg/mL .

Analyse de l'activité :

L’activité de la Cas9-GFP a été testée in vitro en la comparant avec une Cas9 commerciale. Deux tests ont été réalisés : un test d’efficacité et un test de spécificité. L’échantillon produit par la plateforme donne des résultats comparables à l’enzyme commerciale.

Efficacité :

 

 

 

 

 

 

 

Spécificité :